CRISPR/Cas9基因編輯技術（包含Base editor）專題研討會

2022年6月18～19日 ???網絡精講班

莫速乎科研會議平臺主辦

??? 基因編輯技術指能夠讓人類對多個物種內的目標基因進行“精確編輯”，實現對特定DNA片段的刪除、插入、定點突變等。與傳統的TALEN和ZFN基因編輯技術相比，CRISPR/Cas9技術自問世以來，以其操作的便捷性，高效的基因編輯能力獲得青睞，成為當下科研工作者的新寵兒。目前該技術已廣泛應用于人、大鼠、小鼠、斑馬魚、果蠅、豬、水稻、小麥和擬南芥等動植物（細胞）以及細菌等微生物的基因組靶向改造，并已在功能基因組研究、疾病防治、動植物育種、動物疾病模型開發、基因治療等領域展現出巨大的應用前景。

大量從事醫學和生命科學的研究者，都將會在自身的研究領域中用到CRISPR/Cas9基因編輯技術，但在實際操作中，由于各種原因常常遭遇技術瓶頸，因而無法順利地達成實驗目標。本次研討會將深入系統的講解CRISPR/Cas9基因編輯工具原理，操作流程，理論結合實踐，同時講解實驗操作容易遇到的問題及注意事項、解決方法，將讓大家詳細了解到具體如何利用CRISPR/Cas9技術構建基因修飾動物等。本次學習班將組建微信群與老師深入交流探討，幫助解決后續實驗過程中遇到的技術及理論問題?？商崆皽蕚浜米约嚎蒲兄杏龅降膯栴}，通過現場及后續的交流探討，全面掌握CRISPR/Cas9技術應用的方法及技巧，避開科研路上的彎路和陷阱，輕松成為科研達人。

本次研討會主辦單位：

莫速乎科研教育（上海莫速乎教育投資有限公司） 上海荊麥信息科技中心

主講專家：

主講專家來自中國科學院，先后參與并承擔973、863、國家自然基金課題及轉基因重大專項課題。研究領域為基因組編輯、體細胞核移植、疾病模型的建立以及胚胎發育過程中表觀遺傳學研究等。有豐富的理論和實際研究經驗。學員通過與專家直接交流，能夠分享到這些頂尖學術機構的研究經驗和實驗設計的思路。學員通過集中專題學習后能夠擴展思路，在研究技術方面領悟更多。

課程目標：

1、???? 掌握基因打靶與基因編輯技術(ZNF,TALENs,CRISPR/Cas9)，能夠設計sgRNA靶點，構建CRISPR/Cas9質粒，用于基因敲除和敲入。

2、???? 掌握CRISPR/Cas9質粒轉染方法, 陽性細胞克隆篩選方法體系，基因編輯細胞系的建立，基因修飾情況分析方法。

3、???? 掌握CRISPR/Cas9脫靶產生的原因，脫靶檢測方法，降低脫靶問題的方法

4、???? 掌握CRISPR/Cas9的實際應用，對構建基因修飾小鼠和基因修飾大動物（豬）有較深入了解。

5、???? 掌握新基因編輯工具，如：Cpf1, C2C2, base editing等。

6、???? 掌握基因編輯研究領域前沿進展，基因編輯工具的拓展應用、臨床應用等，形成利用基因編輯工具結合自己研究內容等科學思維。

課程安排：(具體課程進度根據實際反饋情況進行適當調整)

課程安排：(具體課程進度根據實際反饋情況進行適當調整)

第一天上午8:30-11:30

一、基因編輯技術概述

1、轉基因與基因打靶技術

2、基因敲除與基因敲入技術

3、基因編輯技術的開創者——ZFNs

4、細胞基因組DNA的修復機制

5、第二代基因編輯技術——TALENs

6、第三代基因編輯技術——CRISPR/Cas9

7、基因編輯技術有多火？

二、CRISPR/Cas9基因組編輯技術原理

1、CRISPR/Cas系統

? 1.1、CRISPR/Cas系統的發現

? 1.2、CRISPR/Cas系統的組成

? 1.3、CRISPR/Cas系統的工作原理

2、CRISPR/Cas9技術的發展及其應用

? 2.1、CRISPR/Cas9技術的建立

? 2.2、CRISPR/Cas9技術的應用

? 2.3、CRISPR/Cas9技術的脫靶問題

三、Cas蛋白的選擇

1、Cas蛋白的選擇?

? 1.1、Cas蛋白的分類

? 1.2、三種應用最廣泛的Cas蛋白

1.3、Cas9蛋白的結構特點簡介

1.4、Cas9蛋白與PAM序列???

? 1.5、Cas9的密碼子優化與NLS

? 1.6、如何選擇Cas蛋白？

2、Cas蛋白資源查詢

3、以上內容相關實驗的注意事項、實驗技巧、實驗結果講解

第一天下午13:30-17:00

四、CRISPR（gRNA）的設計與制備

1、設計gRNA之前需要確定的事（編輯策略的選擇、基因結構分析及查詢方法）

2、RNA的設計（在線互動設計演練）

3、gRNA表達載體的構建

3.1、gRNA的體外表達（RNP）

3.2、gRNA細胞表達載體構建

3.3、常見gRNA/Cas蛋白表達載體

4、以上內容相關實驗的注意事項、實驗技巧、實驗結果講解

五、gRNA活性檢測

1、? Indel突變檢測的基本策略

1.1、錯配內切酶法（EMC）

1.2、TIDE/ICE分析法

1.3、TA克隆法

1.4、酶切片段長度多態性法（RFLP）

1.5、其他方法

2、基于胚胎的活性驗證方法

3、以上內容相關實驗的注意事項、實驗技巧、實驗protocol、實驗結果講解

六、基因編輯工具Cas12a(Cpf1)

1、Cpf1的發現

2、Cpf1與Cas9的區別

3、Cpf1的應用案例

4、Cpf1可同時介導多個基因的編輯

第二天上午8:30-11:30

七、利用CRISPR/Cas9技術創建基因組編輯細胞系

1、目標基因的基因組組成分析

? 1.1 目標基因在目的細胞中的表達情況

? 1.2 如何確定基因的重要的功能域

? 1.3 可變剪接及多轉錄本

2、基因組編輯策略設計

? 2.1基因敲除

? 2.2基因敲入

? 2.3定點突變

? 2.4大片段刪除

3、sgRNA的設計與活性驗證

? 3.1 如何選擇位置合適的gRNA？

4、用于基因敲入的供體DNA的設計

? 4.1 Donor DNA的形式

? 4.2 使用ssODN作為Donor

? 4.3 設計ssODN的要點

? 4.4 插入位點與DSB位點一致的情況

? 4.5 插入位點與DSB位點不一致的情況

5、質粒（和/或供體）導入細胞系的方法（脂質體轉染，電轉，病毒轉導）

6、陽性克隆篩選

? 6.1 抗生素篩選（Protocol）

? 6.2 挑單細胞克?。≒rotocol）

? 6.3 基因型鑒定

6.4 根據打靶效率估算需要篩選的克隆數量

? 6.5 有限稀釋法稀釋細胞的流程（Protocol）

??6.6 基因型鑒定

7、基因組編輯細胞系的建立

8、提高基因敲入（同源重組）效率的策略

9、以上內容相關實驗的注意事項、實驗技巧、實驗protocol、實驗結果講解

八、CRISPR/Cas系統介導的基因編輯案例介紹

1、CRISPR常規工作流程

2、Knock-out案例1

3、Knock-out案例2

4、Knock-in案例

第二天下午13:30-17:00

九、利用CRISPR技術創建基因組編輯動物

1、CRISPR/Cas方法與傳統方法的比較

2、基因編輯動物制備流程

3、通過顯微注射法制備基因編輯小鼠

3.1、小鼠的超排和顯微注射

3.2、胚胎移植和基因型鑒定

3.3、顯微注射法獲得的基因編輯動物的鑒定

4、通過體細胞克隆法制備基因編輯動物

? 4.1、供體細胞分離、培養

? 4.2、供體細胞的基因編輯

? 4.3、體細胞核移植操作

? 4.4、胚胎移植

? 4.5、基因編輯個體的鑒定和擴繁

十、CRISPR轉錄抑制/轉錄激活以及CRISPR screen

1、dCas9的特征簡介

2、運用CRISPR技術進行轉錄調控的原理

3、CRISPR轉錄抑制/轉錄激活技術及優化

4、CRISPRoff

5、CRISPR screen及CRISPRa/i screen（高通量篩選）

十一、單堿基編輯與單堿基編輯器（CBE、ABE、PE）

1、? 單堿基編輯器的原理

2、? 單堿基編輯器的優化

3、? 先導編輯技術原理及其應用

十二、基因編輯技術的脫靶問題

1、? 脫靶產生的原因

2、? 基因編輯工具的脫靶風險

3、? 脫靶檢測方法

4、? 如何降低脫靶？

十三、Cas12和Cas13蛋白及其應用

1、? Cas12和Cas13與Cas9的差異

2、? Cas13特點及其在核酸檢測中的應用

3、? SHERLOCK及DETECTR系統原理

十四、基因編輯技術相關資源

介紹CRISPR/Cas系統以及基因編輯相關的質粒、gRNA、文庫、細胞、Protocol以及技術blog等資源。

會務信息

時間地點：

2022/6/18-19? ?網絡精講班

3200元/人 ?注冊費包含網絡直播平臺費、專家講課費及視頻課程的費用。注冊費用

主辦單位：莫速乎教育（上海莫速乎教育投資有限公司）、上海荊麥信息科技中心

其他須知：

1、 請自備筆記本電腦。請確保電腦安裝的是WINDOWS的操作系統

2、 所用軟件會前兩天發到微信群，請下載安裝。

3、 會議期間寄送經蓋章的紙質邀請函、發票供報銷使用。

4、 報名后會微信發送給您更詳細的參會須知和電子版邀請函。